快速生物降解性：301B CO₂产生试验的测试数据阅读与应用指南

1 方法概览
301B CO₂产生试验是OECD 301系列中基于CO₂产生量的方法，又称改良Sturm试验。该方法通过测量微生物降解受试物过程中产生的CO₂量，与理论最大CO₂产生量（ThCO₂）相比，计算生物降解率。
301B的核心特点是：CO₂是微生物好氧代谢含碳物质的直接产物，因此CO₂产生量是最终生物降解的直接证据。与DOC去除不同，CO₂产生几乎不受吸附、挥发等非生物过程的干扰——极少有非生物过程会产生CO₂。这使得301B特别适用于难溶物质和吸附性物质的评价。
301B与ISO 9439:1999、GB/T 21856—2008实质对应。GB/T 21856—2008等同采用OECD 301B，增加了范围、术语与定义、质量控制等内容。ASTM D5864-23是专门针对润滑剂及其组分的CO₂产生试验方法，原理与301B一致，但在接种物预处理、参比物选择（水不溶物用低芥酸菜籽油）和有效性标准方面有所差异。
301B的通过水平为60% ThCO₂，低于DOC类方法的70%，原因在于部分碳被同化进入微生物细胞，不会以CO₂形式释放。两者在科学上是等价的。

2 测试原理
在矿物盐培养基中加入已知浓度的受试物（10–20 mg DOC或TOC/L），作为唯一碳源和能源，接种混合微生物群体。在黑暗或漫射光条件下，用去除CO₂的空气以受控速率对培养基进行曝气。CO₂随气流排出，被氢氧化钡或氢氧化钠溶液吸收。通过滴定剩余碱液或测定无机碳（IC）浓度，计算CO₂产生量。测试通常持续28天。
CO₂产生量经空白接种物校正后，表示为理论CO₂产生量（ThCO₂）的百分比。ThCO₂根据受试物的碳含量计算：每12 g碳完全氧化产生44 g CO₂。
ThCO₂计算公式为：
ThCO₂ = ρC × VL × 44/12
其中ρC为受试物有机碳浓度（mg/L），VL为测试液体积（L）。
生物降解率计算公式为：
D = (ΣmTt − ΣmBt) / ThCO₂ × 100
其中ΣmTt为测试瓶在时间t内累积释放的CO₂量（mg），ΣmBt为空白瓶在时间t内平均累积释放的CO₂量（mg）。
CO₂产生试验的一个关键特点是：部分CO₂会以溶解性无机碳（DIC）形式留在液体中，导致中间时间点的CO₂收集量低估。ISO 9439:1999明确指出，当有机碳接近完全去除时，DIC浓度逐渐下降，趋于零。因此，测试结束时必须酸化培养基，将残留的DIC释放出来，才能完整测定生物产生的CO₂。这一特点对10天窗口的判定有重要影响——基于CO₂收集量的降解曲线，其动力学速率可能低于基于DOC去除的速率。
对于水溶性受试物，可同时测定DOC去除率作为补充信息。ISO 9439:1999附录D提供了CO₂和DOC联合测定的方法，可使用更高浓度的接种物（可达150 mg/L悬浮固体）和受试物（40 mg C/L），提高降解潜力。

3 适用范围与物质性质要求
3.1 适用物质
301B适用于以下物质：
（1）可溶于水的物质；
（2）难溶于水的物质（需按ISO 10634:2018进行特殊分散处理）；
（3）不挥发的物质。
OECD 301表1中，301B对难溶物质标记为“+”（适用），对挥发性物质标记为“-”（不适用），对吸附性物质标记为“+”（适用）。这表明301B是评价难溶物质和吸附性物质的首选方法之一。
GB/T 21856—2008明确指出，本标准适用于测试可溶于水的、难溶于水的、不挥发的或有吸附作用的化学品的快速生物降解性。
ISO 9439:1999同样规定，该方法适用于水溶性物质、难溶性物质（需特殊分散处理）、不挥发或蒸气压可忽略的物质，以及在测试浓度下不抑制测试微生物的物质。
3.2 不适用物质
以下物质通常不应使用301B：
（1）挥发性物质：受试物在曝气过程中可能从体系中逸出，导致CO₂产生量假低。ISO 9439:1999明确指出，挥发性物质应使用ISO 9408（密闭呼吸计法）或ISO 14593（密闭瓶CO₂法/顶空试验）。GB/T 21856—2008同样规定不适用于挥发性物质。
（2）在测试浓度下抑制微生物的物质：需先进行毒性测试或设置毒性对照。
3.3 难溶物质的制备与处理
难溶于水的有机化合物（水中溶解度小于约100 mg/L）无法通过常规储备液方式加入测试体系。ISO 10634:2018第二版（取代1995年第一版）提供了系统的制备和处理技术，适用于后续ISO 9439（CO₂产生试验）、ISO 9408（密闭呼吸计法）和ISO 10707（密闭瓶法）等生物降解测试。
ISO 10634:2018强调，由于难溶物质的理化性质差异大，不存在单一通用的分散方法。选择最合适的方法应基于实验室经验、产品信息及受试物性质。该标准描述了以下主要制备技术：
（1）直接添加：将受试物直接称量加入测试容器，适用于难溶化合物，避免制备储备液。固体可研磨至尽可能细的颗粒；非粘性液体可用高精度注射器加入。测试容器需持续搅拌。
（2）惰性载体吸附：将受试物吸附或称量于惰性载体上（如硅胶、玻璃纤维滤纸、显微镜载玻片、不锈钢载玻片等），然后加入测试容器。载体应为非生物降解性且不释放有机或无机碳。需注意，吸附于惰性载体可能限制受试物的生物可利用性，导致降解结果偏低；对于毒性物质，生物可利用性的限制可能降低毒性效应，导致降解结果偏高。
（3）超声分散：使用超声探头（约20–35 kHz）或超声浴（约20–35 kHz）处理5–30分钟，然后静置15–30分钟。适用于非挥发性液体和固体化合物。需注意超声可能导致化合物分解（因温度升高），可通过温度控制、降低功率或间歇超声避免。如无法获得稳定乳液或足够高的浓度，可将受试物直接加入测试介质，在加入接种物前于测试容器内超声分散。
（4）乳化剂/溶剂分散：使用非生物降解、对细菌无毒的乳化剂、溶剂、矿物油或硅油制备分散体或乳液。使用乳化剂制备储备液或测试分散体通常是最不受欢迎的方法。所有辅助物质（乳化剂、溶剂、油等）均需设置对照，验证其自身降解不超过受试物降解的10%。
（5）方法组合：可组合使用上述化学方法和物理方法（如超声分散与硅油组合）。建议同时平行进行直接添加和分散技术的测试，以判断哪种技术占主导，或两者是否共同提高生物可利用性和降解。
ISO 10634:2018附录A给出了蒽醌（anthraquinone）在不同制备方法下的生物降解曲线示例。结果显示，直接添加法未能通过60%阈值；惰性载体吸附和乳化剂分散法在28天通过了60%阈值，但未满足10天窗口；硅油分散以及硅油+乳化剂组合法在10天窗口内通过了60%阈值，证明蒽醌为快速生物降解。
注意事项： ISO 10634:2018明确指出，某些制备方法可能不被监管机构接受用于判定快速生物降解性。溶剂和分散/乳化技术的使用可能引入额外的不确定性，导致测试结果与不使用这些技术时不同。分散体或乳液在自然界中可能并不以该形式存在。因此，建议同时进行直接添加和分散技术的平行测试。

4 测试条件与操作要点
4.1 培养基与受试物加入
矿物盐培养基由磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、钙、镁、铁等盐类组成。受试物浓度通常为10–20 mg DOC或TOC/L。水溶性超过1 g/L的物质可配成储备液加入；水溶性较低的物质可直接加入矿物培养基中或按ISO 10634:2018处理。
4.2 接种物
接种物可来自活性污泥、污水出水、地表水、土壤或其混合。使用活性污泥时，浓度不超过30 mg/L悬浮固体。
OECD 301A中关于接种物来源、预处理和预调节的详细规定适用于301B。接种物可在无受试物条件下预调节（曝气5–7天，降低空白值），但不得预暴露于受试物。
ISO 9439:1999规定，接种物的“合适体积”应满足以下条件：足以提供足够的生物降解活性；使参考物在规定时间内达到规定降解百分比；最终混合液中菌落形成单位为10³–10⁶个/mL；活性污泥浓度不超过30 mg/L；接种物贡献的DOC小于受试物引入DOC的10%；通常每100 mL测试液使用1–10 mL接种物。
ASTM D5864-23对接种物的要求有所不同：可使用活性污泥上清液（1%体积比）、土壤悬浮液滤液、地表水滤液或其复合接种物。接种物应含10⁶–20×10⁶ CFU/mL。ASTM D5864-23允许接种物预适应，方法是在含25 mg/L无维生素酪蛋白氨基酸和25 mg/L酵母提取物的接种物中，于第0、7、11天分别加入相当于4、8、8 mg C/L的受试物，第14天均质化并过滤后使用。
4.3 培养条件
在2–5 L烧瓶中加入矿物培养基和接种物，最终体积通常为3 L。在20–25°C、黑暗条件下培养。用去除CO₂的空气以30–100 mL/min的速率曝气。ISO 9439:1999规定温度为20–25°C，变化不超过±2°C。难溶物质需持续搅拌以保持分散状态（密闭瓶法除外）。
4.4 CO₂吸收与测定
OECD 301B和ISO 9439:1999推荐两种CO₂测定方式：
（1）氢氧化钡法：每个测试瓶串接三个吸收瓶，各含100 mL 0.0125 M Ba(OH)₂溶液。CO₂与Ba(OH)₂反应生成BaCO₃沉淀。定期取下最靠近测试瓶的吸收瓶，用0.05 M HCl滴定，酚酞作指示剂。CO₂产生量计算公式为：mT = 1.1 × (50 − V)，其中V为滴定消耗的HCl体积（mL）。其余吸收瓶前移，末端添加新吸收瓶。
（2）氢氧化钠法：每个测试瓶串接两个吸收瓶，各含200 mL 0.05 M NaOH溶液。用注射器从最靠近测试瓶的吸收瓶中取样，注入碳分析仪的IC部分直接测定无机碳。第二个吸收瓶仅在测试结束时分析，用于校正CO₂携带。
ISO 9439:1999附录B提供了两种方法的详细计算示例。氢氧化钡法的CO₂质量计算公式为mT = 1.1(50 − VA)，适用于Ba(OH)₂浓度为0.0125 M、HCl浓度为0.05 M、吸收液体积为100 mL的标准条件。氢氧化钠法的CO₂质量计算公式为mTt = (ρT − ρB) × 3.67 / 10，其中ρT和ρB分别为测试瓶和空白瓶的DIC浓度（mg/L），3.67为CO₂/C质量比（44/12），10为100 mL吸收液体积的换算因子。
4.5 取样频率
OECD 301B规定，前10天建议每隔1–2天测定一次CO₂，之后至少每5天测定一次，直至第28天，以便识别10天窗口。ISO 9439:1999要求根据CO₂释放速率确定测量频率，达到平台期后可结束测试。通常最大测试周期不超过28天。如果降解明显开始但尚未达到平台期，可将测试延长1–2周。
4.6 测试结束
第28天（或平台期后），测定pH，向每个测试瓶中加入1 mL浓盐酸酸化，继续曝气过夜以释放残留的CO₂，次日（第29天）进行最后一次CO₂测定。ISO 9439:1999规定酸化后继续曝气最多24小时，然后测定各瓶释放的CO₂量。
如果28天内CO₂产生已达到平台期（至少三次测定显示稳定），可提前结束测试。平台期的定义是：生物降解率趋于稳定，不再有明显增加。

5 质量控制与有效性
5.1 程序对照
程序对照通常由参考物加接种物组成，用于检查整个测试程序是否正常。OECD 301B和ISO 9439:1999常用的参考物为苯胺（新蒸馏）、乙酸钠或苯甲酸钠。GB/T 21856—2008同样推荐苯胺、醋酸钠或苯甲酸钠作为参比物。
ISO 9439:1999规定，参考物在14天后的降解百分比必须大于60% ThCO₂。如果参考物未通过，测试无效，应重做。
ASTM D5864-23对参比物的选择有所不同：水溶性受试物使用苯甲酸钠或苯胺；水不溶性受试物使用低芥酸菜籽油（LEAR，如菜籽油），其脂肪酸组成中芥酸含量不超过2%。参比物必须在28天内达到>60% ThCO₂，否则测试无效。
5.2 空白对照
空白对照只含接种物、不含受试物，用于校正接种物自身的内源呼吸。OECD 301B规定，试验结束时接种物空白对照中CO₂产生总量通常不高于40 mg/L。如果高于70 mg/L，应对数据和试验方法进行检验。ISO 9439:1999规定，3 L测试体积下空白CO₂产生量约为40 mg/L，不超过70 mg/L。
ASTM D5864-23规定，试验结束时空白对照的总CO₂产生量超过75 mg CO₂/3 L培养基，则测试无效。
5.3 毒性对照
如果怀疑受试物可能抑制微生物活性，应设置毒性对照瓶，同时含受试物和参考物。OECD 301B规定，若14天内DOC降解低于35%，或ThOD/ThCO₂低于25%，可认为受试物具有抑制作用。ISO 9439:1999规定，若毒性对照瓶中参考物的降解百分比低于25%，可认为受试物具有抑制作用，应使用更低浓度或另一接种物重做测试。
5.4 无菌对照
无菌对照用于检查非生物降解。OECD 301B规定，通过加入适当浓度的毒性物质灭菌，或通过膜过滤灭菌。ISO 9439:1999规定，无菌对照瓶含受试物但不含接种物，通过高压灭菌或加入适当无机毒性物质（如1 mL/L的10 g/L HgCl₂溶液）灭菌。如果无菌对照中观察到显著CO₂释放（>10%），可能存在非生物降解过程。ISO 9439:1999建议，无菌对照的CO₂释放量仅在测试结束时测定，以避免因空气CO₂引入造成假阳性。
5.5 辅助物质对照
当使用乳化剂、溶剂、矿物油、硅油或其他添加剂时，必须设置辅助物质对照，验证其自身降解不超过受试物降解的10%。辅助物质对照的结果应在计算受试物结果时予以考虑。ISO 10634:2018要求所有辅助物质（乳化剂、溶剂、油等）均需进行对照测试。
5.6 有效性标准
（1）平行样差异：去除率极差应小于20%。
（2）参考物：14天内达到>60% ThCO₂（OECD 301B、ISO 9439:1999）；28天内达到>60% ThCO₂（ASTM D5864-23）。
（3）初始无机碳：试验开始时受试物悬浮液的无机碳含量必须低于总碳的5%。
（4）空白CO₂：试验结束时接种物空白对照中CO₂产生总量通常不高于40 mg/L，高于70 mg/L需检验（OECD 301B、ISO 9439:1999）；不超过75 mg CO₂/3 L（ASTM D5864-23）。
（5）pH：测试结束时pH应在6–8.5范围内。如果pH超出此范围且降解率低于60%，建议使用更低浓度重做测试。
（6）辅助物质对照：使用辅助物质时，其自身降解不超过受试物降解的10%。
5.7 含氮物质的硝化校正
对于含氮受试物，硝化作用可能消耗额外氧气，但不影响CO₂产生量的测定。301B以CO₂为测量参数，硝化作用不直接干扰CO₂测定。然而，如果同时进行DOC测定或氧气消耗测定，则需注意硝化校正。OECD 301附录V提供了硝化校正的详细方法。

6 报告关键内容
一份完整的301B测试报告应包含：
（1）测试方法：引用OECD 301B、ISO 9439:1999或GB/T 21856—2008。
（2）受试物：名称、CAS号、结构式、纯度、水中溶解度、挥发性、吸附性等关键理化性质。
（3）测试条件：方法编号、接种物来源和浓度、预处理、温度、测试体积、受试物加入方式、CO₂吸收方法（Ba(OH)₂或NaOH）。
（4）难溶物质制备：如适用，引用ISO 10634:2018，说明制备方法、处理时间和强度、载体或添加剂的种类和用量、受试物在乳液或分散体中的浓度、载体上受试物的回收率。
（5）结果：CO₂原始数据表、累积CO₂产生量、降解曲线、平行样、空白对照、程序对照（参考物名称及降解结果）、毒性对照（如适用）、无菌对照（如适用）、辅助物质对照（如适用）。
（6）曲线参数：滞后期、降解期、10天窗口、平台期、平台值。
（7）CO₂分析系统主要特性。
（8）讨论：是否通过、是否抑制、是否有非生物去除、是否有异常现象、测试被拒绝的原因（如有）。
（9）结论：是否判定为快速生物降解。

7 结果解读
7.1 通过判定
（1）达到60% ThCO₂，且在10天窗口内完成，且不晚于第28天——判定为快速生物降解。
（2）10天窗口从CO₂产生率达到10% ThCO₂时开始计时。
（3）如果28天内达到60%但未满足10天窗口，通常不被判定为快速生物降解。
7.2 曲线形态
（1）滞后期：从测试开始到CO₂产生达到约10% ThCO₂的时间。
（2）降解期：从滞后期结束到达到最大降解约90%的时间。
（3）平台期：CO₂产生曲线趋于平缓，达到最大降解水平。
（4）平台值：报告通常给出平台期平均降解率或最高值。
7.3 CO₂滞留问题与10天窗口
ISO 9439:1999明确指出，部分CO₂会以DIC形式留在液体中，导致基于CO₂收集量的降解曲线，其动力学速率可能低于基于DOC去除的速率。这意味着：
（1）基于CO₂收集量的10天窗口判定可能偏严；
（2）某些在DOC去除上满足10天窗口的物质，可能在CO₂产生上不满足；
（3）最终28天值不受影响，因为酸化后残留DIC被释放并测定。
OECD 301B规定，如果CO₂产生试验中降解率低于预期，可能存在DIC积累，此时可用其他OECD快速生物降解测试方法评估降解性。
7.4 难溶物质的解读
难溶物质的生物降解结果高度依赖制备方法。ISO 10634:2018附录A的蒽醌示例表明：直接添加法未通过60%阈值；惰性载体吸附和乳化剂分散法在28天通过60%阈值但未满足10天窗口；硅油分散和硅油+乳化剂组合法在10天窗口内通过60%阈值。这说明分散技术可能显著影响生物可利用性和降解速率，进而影响10天窗口的判定。
注意事项： 使用分散技术时，应同时进行直接添加的平行测试，以评估分散技术是否人为提高了降解率。某些制备方法可能不被监管机构接受用于判定快速生物降解性。
7.5 未通过的解读
未通过301B不等于不可降解。OECD 301指南明确指出：“由于方法的严格性，低值不一定意味着受试物在环境条件下不可生物降解，而是表明需要进一步工作来确定其生物降解性。”ISO 9439:1999附录B也指出，未通过快速生物降解测试的物质，如果在一项固有生物降解测试中显示一定的矿化，则不被认为具有持久性。
未通过后应进入固有生物降解测试（如302系列）或模拟测试。

8 登记应用要点
8.1 收到报告先看什么
（1）受试物是否可溶或不溶？是否不挥发？是否有吸附倾向？
（2）方法是否选择了301B？是否适合受试物性质？
（3）难溶物质是否按ISO 10634:2018进行了适当的制备和处理？是否设置了辅助物质对照？
（4）程序对照参考物是否14天达到>60% ThCO₂？
（5）平行样差异是否小于20%？
（6）空白对照CO₂产生量是否不超过40 mg/L（或70 mg/L上限）？
（7）初始无机碳是否低于总碳的5%？
（8）是否有毒性对照？是否显示抑制？
（9）是否有无菌对照？是否显示非生物去除？
（10）是否给出10天窗口和平台值？
（11）是否给出完整原始CO₂数据和曲线？
8.2 能否直接用于登记
（1）通过且方法合适、质量控制合格——通常可用于登记卷宗。
（2）未通过——需判断是否需要固有测试或模拟测试。
（3）方法选择不当（如挥发性物质用了301B）——数据可能不被监管接受，应要求实验室说明或重做。
（4）难溶物质使用了分散技术但未设置辅助物质对照——数据可能不被接受，应要求补充。
（5）报告缺少关键信息——应要求补充。
8.3 何时需要进一步测试
（1）301B未通过，但物质可能具有固有降解性——做302系列。
（2）物质为挥发性——考虑ISO 14593（OECD 310）或ISO 9408（OECD 301F）。
（3）难溶物质结果不确定或分散技术可能影响结论——考虑同时进行直接添加和分散技术的平行测试，或咨询监管机构。
（4）需要了解在污水处理厂、河流等实际环境中的降解速率——做303、309等模拟测试。
（5）高吨位或高关注物质——监管可能要求模拟测试。

9 常见问题
Q1：301B的60% ThCO₂和301A的70% DOC去除，哪个更容易通过？
数值本身不能直接比较。两者在科学上等价，差异来自测量参数不同。301B追踪的是“碳被氧化了多少”，301A追踪的是“碳被用掉了多少”。部分碳被同化进入细胞，不会以CO₂形式释放，因此ThCO₂的通过水平低于DOC。
Q2：301B可以测挥发性物质吗？
通常不建议。挥发性物质在曝气过程中可能逸出，导致CO₂产生量假低。ISO 9439:1999和GB/T 21856—2008均明确指出不适用于挥发性物质。挥发性物质应选择ISO 14593（OECD 310）或ISO 9408（OECD 301F）。
Q3：301B可以测难溶物质吗？
可以。301B是评价难溶物质的首选方法之一。OECD 301表1中，301B对难溶物质标记为“+”。难溶物质的制备和处理应参照ISO 10634:2018，选择适当的分散技术，并设置辅助物质对照。ASTM D5864-23专门针对润滑剂等水不溶性物质设计，允许超声处理改善分散。
Q4：CO₂产生60%但未满足10天窗口，结果如何判定？
不被判定为快速生物降解。该物质需要进入固有生物降解测试或模拟测试。但需注意，CO₂滞留可能导致10天窗口判定偏严，可与实验室讨论是否同时测定DOC作为补充信息。
Q5：301B和301A有什么区别？
两者原理不同：301A测DOC去除，301B测CO₂产生。301A适用于水溶性、不挥发、不吸附的物质；301B适用于可溶或不溶、不挥发的物质，包括吸附性物质。301A的通过水平为70% DOC，301B为60% ThCO₂。两者在科学上等价。
Q6：ISO 9439:1999和OECD 301B有什么区别？
两者在原理、通过水平和10天窗口要求上一致。ISO 9439:1999在术语定义（如滞后期、降解期、平台期）、接种物“合适体积”的标准、CO₂测定方法（DIC法和滴定法）、有效性标准和报告内容方面提供了更详细的规范。如果目标市场接受ISO标准，ISO 9439:1999是OECD 301B的等效替代。
Q7：GB/T 21856—2008和OECD 301B有什么关系？
GB/T 21856—2008等同采用OECD 301B（1992年），增加了范围、术语与定义、质量控制等内容，将计量单位改为我国法定计量单位。如果目标市场为中国，GB/T 21856—2008是适用的国家标准。
Q8：ASTM D5864-23和OECD 301B有什么关系？
ASTM D5864-23是专门针对润滑剂及其组分的CO₂产生试验方法，原理与OECD 301B一致。主要差异在于：接种物预处理（允许预适应）、参比物选择（水不溶物用低芥酸菜籽油）、有效性标准（空白CO₂不超过75 mg/3 L，参比物28天>60% ThCO₂）。如果目标市场为美国或需要专门针对润滑剂的数据，ASTM D5864-23是适用方法。
Q9：ISO 10634:2018是什么？和301B有什么关系？
ISO 10634:2018是难溶于水有机化合物的制备和处理指南，第二版于2018年发布，取代1995年第一版。它为后续生物降解测试（包括ISO 9439 CO₂产生试验）提供分散技术规范。当受试物水中溶解度小于约100 mg/L时，应参照该标准选择适当的制备方法。该标准强调，某些制备方法可能不被监管机构接受用于判定快速生物降解性，建议同时进行直接添加和分散技术的平行测试。
Q10：使用分散技术时，为什么必须设置辅助物质对照？
分散技术可能使用乳化剂、溶剂、矿物油、硅油等辅助物质。这些辅助物质本身可能被微生物降解，或对微生物产生毒性。设置辅助物质对照可验证其自身降解不超过受试物降解的10%，确保受试物降解结果不受辅助物质干扰。ISO 10634:2018要求所有辅助物质均需进行对照测试。

10 结语
301B CO₂产生试验是快速生物降解性测试中直接追踪矿化产物的方法，通过CO₂产生量评估化学品是否具有在好氧环境中快速降解的潜力。ISO 9439:1999、GB/T 21856—2008、ISO 10634:2018和ASTM D5864-23作为其国际、国家和行业标准对应版本，在术语、操作、难溶物质处理和有效性方面提供了更详细的规范。
从实际应用角度看，重点把握三个方面：方法是否适合受试物性质（水中溶解度、挥发性、吸附性）、质量控制是否合格（程序对照、空白、平行样、无菌对照、辅助物质对照）、结果是否满足60% ThCO₂通过水平和10天窗口。
收到301B报告时，特别关注CO₂滞留问题对10天窗口的影响、难溶物质的制备方法是否符合ISO 10634:2018、辅助物质对照是否设置，以及空白对照和初始无机碳是否符合有效性标准。遇到不确定的地方，及时与实验室沟通，必要时安排固有生物降解或模拟测试。

参考资料
OECD, Test No. 301: Ready Biodegradability, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 1992.
ISO 9439:1999, Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium — Carbon dioxide evolution test.
GB/T 21856—2008, 化学品 快速生物降解性 二氧化碳产生试验.
ISO 10634:2018, Water quality — Preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
ASTM D5864-23, Standard Test Method for Determining Aerobic Aquatic Biodegradation of Lubricants or Their Components.
具体测试方法以OECD官网、ISO官网及ASTM官网最新发布的版本为准。