快速生物降解性：301A DOC消减试验的测试数据阅读与应用指南

1 方法概览
301A DOC消减试验是OECD 301系列中基于DOC分析的方法之一，与ISO 7827:2010实质对应。该方法通过定期测定溶解性有机碳（DOC）的浓度变化来跟踪生物降解过程，将DOC去除率作为降解程度的指标。
301A的核心特点是：使用相对较高的微生物细胞密度，通过DOC分析直接追踪溶解性有机碳的消失。由于DOC去除既可以反映碳被氧化为CO₂，也可以反映碳被同化进入微生物细胞，因此301A的通过水平（70% DOC去除）高于呼吸计量类方法的通过水平（60% ThOD/ThCO₂），两者在科学上是等价的。
ISO 7827:2010与OECD 301A的主要对应关系如下：两者均以DOC去除为测量参数，通过水平均为70%，均适用10天窗口。ISO 7827:2010在术语定义、接种物要求、取样频率和有效性标准方面提供了更详细的规范。

2 测试原理
在矿物盐培养基中加入已知浓度的受试物（10–40 mg DOC/L），作为唯一碳源和能源，接种混合微生物群体，在好氧、黑暗或漫射光、22±2°C条件下振荡培养28天。定期取样，过滤或离心去除微生物细胞后，测定滤液或上清液中的DOC浓度。
DOC在操作上定义为能通过0.45 μm滤膜或离心得上清液的有机碳。DOC去除率通过以下公式计算：
wDOC,t = [1 − (ρt − ρBt) / (ρ0 − ρB0)] × 100
其中ρ0为起始DOC浓度，ρt为时间t的DOC浓度，ρB0为空白对照起始DOC浓度，ρBt为时间t的空白对照DOC浓度。所有浓度均需用空白对照校正。结果取整数。
DOC去除反映的是溶解性有机碳被微生物利用的程度，包括两个去向：一是被氧化为CO₂，二是被同化进入微生物细胞。这正是301A通过水平设定为70%而非60%的原因——DOC去除追踪的是“碳被用掉了多少”，而ThOD/ThCO₂追踪的是“碳被氧化了多少”。
ISO 7827:2010进一步明确定义了三个关键曲线参数：滞后期（lag time，t1）为从测试开始到DOC去除达到10%的时间；降解期（degradation time，t2）为从滞后期结束到达到最大降解约90%的时间；最大降解水平（maximum level of biodegradation）为测试期间不再进一步降解的降解程度。

3 适用范围与物质性质要求
3.1 理想适用条件
301A/ISO 7827:2010的理想适用条件为：
（1）在测试浓度下可溶（DOC浓度10–40 mg/L）；
（2）不挥发或在测试条件下蒸气压可忽略；
（3）不显著吸附于玻璃和活性污泥；
（4）在测试浓度下不抑制测试微生物。
OECD 301指南指出，水溶性至少达到100 mg/L的物质，在不挥发、不吸附的前提下，可适用于所有快速生物降解测试方法。301A是DOC类方法，对水溶性有硬性要求。
对吸附性物质应谨慎。OECD 301表1中，301A对吸附性物质标记为“+/-”，说明可能适用，但DOC去除可能受吸附干扰。若受试物有吸附倾向，应设置吸附对照，并评估DOC去除是否主要来自物理吸附而非生物降解。
ISO 7827:2010明确指出，该方法不适用于废水，因为废水通常含有大量水不溶性有机碳，不被DOC测定所涵盖。
3.2 通常不适用的物质
以下物质通常不应使用301A：
（1）难溶物质：DOC类方法无法区分生物降解与物理去除，水溶性差本身可能成为降解的限速步骤；
（2）挥发性物质：受试物在振荡过程中可能从体系中逸出，导致DOC测定值假高；
（3）强吸附物质：受试物被污泥或容器壁吸附，DOC去除无法反映真实的生物降解过程。
对于难溶物质，应选择301B、301C、301D、301F或310；对于挥发性物质，应选择310；对于吸附性强的物质，应选择301B或301F。

4 测试条件与操作要点
4.1 培养基与受试物加入
矿物盐培养基由磷酸盐缓冲液（pH 7.4±0.2）、钙、镁、铁等盐类组成。受试物浓度通常为10–40 mg DOC/L。水溶性超过1 g/L的物质可配成储备液加入；水溶性较低的物质（10–100 mg/L）可直接加入矿物培养基中，确保完全溶解。
ISO 7827:2010要求培养基新鲜配制，溶液A最后加入以避免盐类沉淀。溶液A至C可在室温黑暗条件下保存最多6个月，溶液D（含保护剂）可保存3个月。
4.2 接种物
接种物可来自二次出水、活性污泥、地表水或其混合。
二次出水：取自主处理生活污水的处理厂或实验室装置，混匀后好氧保存，当天使用。静置1小时后取上清液作为接种物。
活性污泥：取自曝气池或污泥回流管，混匀后好氧保存，当天使用。必要时通过离心和重悬洗涤接种物，以降低DOC浓度。使用前测定悬浮固体浓度，最终混合液中不超过30 mg/L。可使用均质处理的活性污泥（3–5 g/L悬浮固体，搅拌器处理不超过2分钟，温度不超过25°C，静置30分钟后取上清液，按10 mL/L加入）。
地表水：取合适地表水样品，好氧保存，当天使用。
ISO 7827:2010规定，接种物的“合适体积”应满足以下条件：足以提供足够的生物降解活性；使参考物在规定时间内达到规定降解百分比；最终混合液中活性细胞数为10³–10⁶个/mL；活性污泥浓度不超过30 mg/L；接种物贡献的DOC小于受试物引入DOC的10%（如受试物浓度为40 mg/L时，接种物DOC<4 mg/L）。
接种物可在无受试物条件下预调节（曝气5–7天，降低空白值），但不得预暴露于受试物。如果使用预暴露接种物，结果应解释为证明受试物具有“固有”生物降解性。
4.3 培养条件
在2升锥形瓶中加入800 mL矿物培养基，接种后补足至1升。在22±2°C、黑暗或漫射光条件下振荡培养。瓶口用铝箔覆盖，允许空气交换。
4.4 取样与分析
在整个28天测试期间，定期从每个瓶中取样测定DOC。ISO 7827:2010要求在第0天、测试结束（通常28天）以及至少三个中间时间点（如第7、14、21天）取样。如果需要识别10天窗口，需要在测试初期增加取样点。
取样前需补足蒸发损失的水分，充分混匀后取样。样品立即用膜过滤（0.2–0.45 μm）或离心（40000 m/s²，25分钟）去除微生物细胞。过滤后的样品当天分析，或4°C保存不超过48小时，或-18°C以下保存更长时间。也可加入适当无机毒性物质（如20 mL/L的HgCl₂溶液）防止微生物活动，4±1°C保存。
如果28天测试期结束前已达到足够程度（>80%）且恒定的降解水平，可认为测试结束。如果降解明显开始但尚未达到平台期，可将测试延长1至2周。

5 质量控制与有效性
5.1 程序对照
程序对照通常由参考物加接种物组成，用于检查整个测试程序是否正常。OECD 301A和ISO 7827:2010常用的参考物为苯胺（新蒸馏）、乙酸钠或苯甲酸钠。这些参考物即使在未故意添加接种物的情况下也能降解，因此程序对照主要验证培养基、培养条件和分析方法是否正常。
ISO 7827:2010规定，参考物在14天后的降解百分比必须大于70%。如果参考物未通过，测试无效，应重做。
5.2 空白对照
空白对照只含接种物、不含受试物，用于校正接种物自身的内源呼吸。在整个测试期间，空白对照需与测试瓶平行跟踪DOC变化。空白对照的DOC值应尽可能低，以提高测试精度。ISO 7827:2010规定，接种物贡献的DOC应小于受试物贡献DOC的10%。
5.3 毒性对照
如果怀疑受试物可能抑制微生物活性，应设置毒性对照瓶，同时含受试物和参考物。ISO 7827:2010规定，若14天内DOC降解低于35%，可认为受试物具有抑制作用。此时应使用更低浓度的受试物或预暴露接种物重做测试。
5.4 非生物去除对照
非生物去除对照（FS瓶）含受试物但不含接种物，通过加入HgCl₂或其他适当无机毒性物质灭菌，或通过过滤灭菌。如果受试物极易降解，建议在测试开始2周后加入等量毒性物质。
通过比较测试瓶（FT）和非生物对照瓶（FS）的去除率，可以判断受试物是否发生了非生物去除（如挥发或吸附）。如果观察到显著的有机碳损失，则无法区分生物去除和非生物去除，此时应使用基于明确指示生物过程的方法，如ISO 9408（呼吸计量法）或ISO 9439（CO₂产生法）。
如果使用活性污泥作为接种物，可设置接种并毒化的吸附对照瓶，以检查受试物是否被污泥显著吸附。
5.5 有效性标准
（1）平行样差异：相同测试浓度和接种物的测试瓶，测试结束时降解值差异应小于20% DOC去除。
（2）参考物：14天后降解百分比大于70%。
（3）接种物DOC贡献：小于受试物贡献DOC的10%。
（4）DOC分析精度：碳分析仪应能在0.5–40 mg/L范围内准确测量，符合ISO 8245:1999要求。ISO 8245:1999适用于有机碳含量0.3–1000 mg/L的水样，当DOC浓度低于0.5 mg/L时，仅在使用高灵敏度仪器的情况下适用。

6 报告关键内容
一份完整的301A/ISO 7827:2010测试报告应包含：
（1）测试方法：引用ISO 7827:2010或OECD 301A。
（2）受试物：名称、CAS号、结构式、纯度、水中溶解度、挥发性、吸附性等关键理化性质。
（3）测试条件：方法编号、接种物来源和浓度、预处理、温度、测试体积、受试物加入方式。
（4）结果：DOC原始数据表、降解曲线、平行样、空白对照、程序对照（参考物名称及降解结果）、毒性对照（如适用）、非生物去除对照（如适用）、吸附对照（如适用）。
（5）曲线参数：滞后期（t1）、降解期（t2）、10天窗口、最大降解水平、平台值。
（6）DOC分析仪主要特性。
（7）讨论：是否通过、是否抑制、是否有非生物去除、是否有异常现象、测试被拒绝的原因（如有）。
（8）结论：是否判定为快速生物降解。

7 结果解读
7.1 通过判定
（1）达到70% DOC去除，且在10天窗口内完成，且不晚于第28天——判定为快速生物降解。
（2）10天窗口从DOC去除率达到10%时开始计时。
（3）如果28天内达到70%但未满足10天窗口，通常不被判定为快速生物降解。
7.2 曲线形态
（1）滞后期（t1）：从测试开始到DOC去除达到10%的时间，通常变异性较大。
（2）降解期（t2）：从滞后期结束到达到最大降解约90%的时间。
（3）平台期：DOC去除曲线趋于平缓，达到最大降解水平。
（4）最大降解水平：测试期间不再进一步降解的降解程度。
7.3 DOC去除的局限
DOC去除可能受到吸附、挥发、沉淀等非生物过程的干扰。如果受试物可能被吸附，应设置非生物去除对照瓶和吸附对照瓶。非生物去除对照可以区分生物降解与物理去除。如果DOC去除主要来自吸附，测试结果可能高估生物降解程度。
7.4 未通过的解读
未通过301A不等于不可降解。OECD 301指南明确指出：“由于方法的严格性，低值不一定意味着受试物在环境条件下不可生物降解，而是表明需要进一步工作来确定其生物降解性。”ISO 7827:2010附录B也指出，未通过快速生物降解测试的物质，如果在一项固有生物降解测试中显示一定的矿化，则不被认为具有持久性，可能在好氧水生环境中中长期降解。
未通过后应进入固有生物降解测试（如302系列）或模拟测试。

8 登记应用要点
8.1 收到报告先看什么
（1）受试物水中溶解度是否至少100 mg/L？是否不挥发？是否有吸附倾向？
（2）方法是否选择了301A/ISO 7827:2010？是否适合受试物性质？
（3）程序对照参考物是否14天达到70% DOC去除？
（4）平行样差异是否小于20%？
（5）空白对照DOC是否足够低？接种物DOC贡献是否小于受试物DOC的10%？
（6）是否有非生物去除对照？是否显示非生物去除干扰？
（7）是否有吸附对照？是否显示吸附干扰？
（8）是否给出10天窗口和平台值？
（9）是否给出滞后期、降解期和最大降解水平？
（10）是否给出完整原始DOC数据和曲线？
8.2 能否直接用于登记
（1）通过且方法合适、质量控制合格——通常可用于登记卷宗。
（2）未通过——需判断是否需要固有测试或模拟测试。
（3）方法选择不当（如难溶物质用了301A）——数据可能不被监管接受，应要求实验室说明或重做。
（4）报告缺少关键信息——应要求补充。
8.3 何时需要进一步测试
（1）301A未通过，但物质可能具有固有降解性——做302系列。
（2）物质有吸附倾向，DOC去除可能被干扰——考虑301B或301F。
（3）需要了解在污水处理厂、河流等实际环境中的降解速率——做303、309等模拟测试。
（4）高吨位或高关注物质——监管可能要求模拟测试。

9 常见问题
Q1：301A的70% DOC去除和301B的60% ThCO₂，哪个更容易通过？
数值本身不能直接比较。两者在科学上等价，差异来自测量参数不同。301A追踪的是“碳被用掉了多少”，301B追踪的是“碳被氧化了多少”。
Q2：受试物水中溶解度刚好接近100 mg/L，能用301A吗？
建议谨慎。水溶性差可能成为降解的限速步骤，导致假阴性。如果水中溶解度在100 mg/L附近，可与实验室讨论是否选择301B、301F或310。
Q3：301A可以测挥发性物质吗？
通常不建议。挥发性物质在振荡过程中可能逸出，导致DOC测定值假高。但中等挥发性物质在瓶内有足够气相空间并密封的条件下，可考虑301A，同时必须设置非生物去除对照校正物理损失。
Q4：DOC去除70%但未满足10天窗口，结果如何判定？
不被判定为快速生物降解。该物质需要进入固有生物降解测试或模拟测试。
Q5：301A和301E有什么区别？
两者原理相同，均测DOC去除，通过水平均为70%。主要区别在于接种物浓度：301A可使用较高细胞密度，301E使用较低浓度（0.5 mL污水出水/L），因此301E的结果变异性可能更大。
Q6：ISO 7827:2010和OECD 301A有什么区别？
两者在原理、通过水平和10天窗口要求上一致。ISO 7827:2010在术语定义（如滞后期、降解期）、接种物“合适体积”的标准、取样频率、有效性标准和报告内容方面提供了更详细的规范。如果目标市场接受ISO标准，ISO 7827:2010是OECD 301A的等效替代。
Q7：ISO 8245:1999和ISO 20236:2024有什么区别？
ISO 8245:1999是TOC/DOC测定的基础指南，现行有效，规定了0.3–1000 mg/L有机碳含量水样的测定方法。ISO 20236:2024在此基础上进行了扩展，将TOC定义为“有机结合碳的总和，无论其是溶解态还是悬浮态”，并增加了总结合氮（TNb）和溶解结合氮（DNb）的测定要求，同时明确要求执行颗粒处理控制（纤维素测试）以验证含颗粒物样品的分析可靠性。在实际操作中，实验室可能依据ISO 8245:1999进行DOC测定，也可能依据ISO 20236:2024进行更全面的TOC/DOC/TNb测定。

10 结语
301A DOC消减试验是快速生物降解性测试中最直接的方法之一，通过DOC去除率评估化学品是否具有在好氧环境中快速降解的潜力。ISO 7827:2010作为其国际标准对应版本，在术语、操作和有效性方面提供了更详细的规范。
从实际应用角度看，重点把握三个方面：方法是否适合受试物性质（水中溶解度、挥发性、吸附性）、质量控制是否合格（程序对照、空白、平行样、非生物去除对照）、结果是否满足70% DOC通过水平和10天窗口。
收到301A/ISO 7827:2010报告时，特别关注非生物去除对照和DOC分析质量，因为DOC去除可能受到非生物过程的干扰。遇到不确定的地方，及时与实验室沟通，必要时安排固有生物降解或模拟测试。

参考资料
OECD, Test No. 301: Ready Biodegradability, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 1992.
ISO 7827:2010, Water quality — Evaluation of the “ready”, “ultimate” aerobic biodegradability of organic compounds in an aqueous medium — Method by analysis of dissolved organic carbon (DOC).
ISO 8245:1999, Water quality — Guidelines for the determination of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC). （现行有效，2021年确认）
ISO 20236:2024, Water quality — Determination of total organic carbon (TOC), dissolved organic carbon (DOC), total bound nitrogen (TNb) and dissolved bound nitrogen (DNb) after high temperature catalytic oxidative combustion.
具体测试方法以OECD官网和ISO官网最新发布的版本为准。