生物降解测试：化学品合规上市的“环境通行证”——基于OECD第2号专题报告及后续新增方法的解读

1 为什么企业必须关注生物降解测试？
1.1 生物降解是环境风险评估的核心参数
（1）生物降解，简单说，就是微生物把化学品“吃掉”或分解掉。
（2）如果分解到二氧化碳、水、无机盐等，叫最终生物降解，也叫矿化。
（3）如果只是分子结构变了一点，叫初级生物降解。

监管机构关注生物降解，主要因为：
（1）难降解的化学品可能在环境中长期存在；
（2）持久性物质可能进一步成为生物累积性、毒性物质；
（3）化学品登记注册通常要求提交生物降解数据，用于PBT/vPvB评估和环境风险评估。

1.2 OECD测试指南是国际“通用语言”
（1）OECD测试指南被许多国家法规引用。
（2）按OECD指南生成的数据，在OECD数据互认（MAD）框架下更容易被成员国接受。
（3）这可以减少重复测试、节省成本、加快登记上市。
（4）但要注意：OECD指南本身不是自动生效的法律，实际申报还要看目标市场法规、GLP要求和数据保护规则。

1.3 这份专题报告的价值
（1）它系统审查了生物降解测试的“科学现状”。
（2）它回答了一个关键问题：现有OECD测试指南够不够用？
（3）主要结论是：不需要开发根本性的全新指南，但需要增补方法、改进策略、解决不溶物和厌氧测试等空白。
（4）后续OECD确实按此方向陆续发布了多项新增指南，本文一并纳入介绍。

2 OECD生物降解测试体系：三层策略
OECD生物降解测试体系通常分为三个层次，形成从严格筛选到接近真实环境的递进关系。
（1）第一层是快速生物降解性。若测试达到通过水平，如70% DOC去除、60% ThOD或ThCO₂，通常认为该物质易生物降解，一般无需进一步生物降解测试；若未达到通过水平，则进入第二层。
（2）第二层是固有生物降解性。若降解率大于70%，认为具有固有生物降解性；若在20%至70%之间，需关注是否形成稳定中间产物；若低于20%，通常认为不具有固有生物降解性，后续按目标市场法规要求处理，可能进入第三层。
（3）第三层是模拟测试，模拟污水处理厂、河流、湖泊、沉积物、海水、土壤等真实环境。模拟测试更接近实际，但复杂、成本高。1995年报告发布时，OECD只有污水好氧处理的标准化模拟方法；此后OECD陆续补充了沉积物、土壤、海水、地表水、污水排放系统等多个模拟方法。

2.1 第一层：快速生物降解性
（1）目的：快速筛选化学品是否容易降解。
（2）常用通过水平：70% DOC去除、60% ThOD或ThCO₂、80%特定分析。
（3）测试期通常28天。
（4）还有“10天窗口”：在降解达到10%后，10天内达到通过水平。
（5）若快速生物降解测试达到规定的通过水平，通常认为该物质在环境中较易降解。

2.2 第二层：固有生物降解性
（1）条件比快速测试更宽松。
（2）污泥浓度更高、测试时间更长、可连续暴露。
（3）如果大于70%降解，认为具有固有生物降解性。
（4）如果20%至70%，需要关注是否形成稳定中间产物。
（5）如果低于20%，通常认为不具有固有生物降解性，后续按目标市场法规要求处理。

2.3 第三层：模拟测试
（1）模拟真实环境，如污水处理厂、河流、沉积物、海水、土壤。
（2）更接近实际，但复杂、成本高。
（3）1995年报告发布时，OECD只有污水好氧处理的标准化模拟方法；自然水、沉积物、海水、土壤尚无统一标准方法。
（4）此后OECD陆续补充了多个模拟方法，覆盖沉积物、土壤、海水、地表水、污水管道、活性污泥、厌氧消化污泥、混合带等场景。

3 现有方法一览
3.1 快速生物降解测试
OECD 301系列快速生物降解测试包括以下方法。
（1）301A DOC消减试验。原理是测溶解有机碳去除；适用于可溶、不吸附、不挥发的物质；关键参数为10–40 mg C/L，28天，通过水平为70% DOC。
（2）301B CO₂产生试验。原理是测CO₂产生；适用于可溶或不溶、不挥发的物质；关键参数为10–20 mg C/L，通过水平为60% ThCO₂。
（3）301C 改进的MITI法（I）。原理是测氧消耗；适用于可溶或不溶、不挥发的物质；关键参数为100 mg/L，通过水平为60% ThOD。
（4）301D 密闭瓶法试验。原理是测溶解氧消耗；适用于可溶性物质，挥发性物质需改装；关键参数为2–5 mg/L，通过水平为60% ThOD。
（5）301E 改进的OECD筛选试验。原理是测DOC去除；适用于可溶性物质；关键参数为10–40 mg C/L，通过水平为70% DOC。
（6）301F 测压呼吸计量法试验。原理是测氧消耗；适用于可溶、不溶以及部分挥发性物质；关键参数为50–100 mg ThOD/L，通过水平为60% ThOD。
（7）310 密闭瓶CO₂法（顶空试验） 。这是后续新增的快速生物降解性筛选方法，采用密闭瓶和顶空设计，通过测定瓶内无机碳的产生量来评估生物降解程度。测试物通常以20 mg C/L作为唯一碳源和能源，在密封瓶中好氧培养28天，通过测定试验瓶与空白对照瓶中无机碳的差值来计算生物降解百分比。通过水平为60% ThIC，需在10天窗口内达到。该方法特别适用于水溶性、难溶性及易挥发性化学品，弥补了301B CO₂产生试验对挥发性物质适用性不足的问题。

从适用性看：301A和301E适合可溶性物质；301B适合不溶性物质，但不适合挥发性物质；301C和301F适合不溶性物质，需专用呼吸仪；301D适合可溶性物质，但氧容量有限；310适合可溶、难溶及易挥发物质，是挥发性物质快速筛选的重要选择。

3.2 固有生物降解测试
固有测试主要包括以下方法。
（1）302A 改进的半连续活性污泥法（SCAS）试验。目的是评估固有生物降解潜力；特点是污泥浓度高，可长期暴露。
（2）302B 赞恩-惠伦斯／EMPA试验。目的同样是评估固有生物降解潜力；特点是高污泥浓度，测DOC或COD去除。
（3）302C 改进的MITI试验（Ⅱ） 。这是后续新增的固有生物降解方法，使用自动化闭式氧消耗测定装置（BOD仪），在试验容器中接种微生物，连续测定生化需氧量，测试周期为14至28天。该方法专门用于评估经标准MITI法（I）判定为低降解性化学品的固有生物降解性，通过BOD曲线和补充化学分析（如溶解有机碳浓度、残留化学品浓度等）综合判断。适用于难溶、易吸附和弱挥发性物质的固有生物降解性评估。
（4）304A 土壤固有生物降解性试验。采用¹⁴C标记化合物，在天然土壤样品中评估矿化速率，无需额外接种。适用于挥发性或非挥发性、可溶或不溶性化合物，前提是不对微生物产生抑制。该方法是OECD在土壤固有生物降解方面的标准化方法，测试周期通常可达64天。

3.3 模拟测试
模拟测试主要包括以下方法。
3.3.1 污水好氧处理
（1）303A 模拟试验——污水好氧处理：活性污泥单元法。模拟活性污泥污水处理；特点是活性污泥单元，包括Husmann单元和多孔罐。适用于可溶性有机化合物在连续运行系统中初级和最终生物降解的评估。
（2）303B 模拟试验——污水好氧处理：生物膜法。这是后续新增的模拟方法，模拟生物膜污水处理系统，如滴滤池、生物转盘和流化床等。将合成或生活污水与测试物质混合后，施加到缓慢旋转的倾斜管内表面，形成生物膜进行降解。适用于需要了解化学品对生物膜法污水处理系统反应的数据时使用。当303A活性污泥单元法不适用或需要特定生物膜处理数据时，303B是有价值的补充。

3.3.2 海水中的生物降解
306 海水中的生物降解性（含306A摇瓶法和306B密闭瓶法）：
（1）306A 摇瓶法：将测试物质溶解在海水培养基中，DOC浓度为5–40 mg/L，在15–20℃、有氧条件下振荡培养，推荐最长测试时间约60天。通过DOC测定评估最终降解，也可用特定分析评估初级降解。
（2）306B 密闭瓶法：将测试物质以2–10 mg/L浓度溶解于海水中，在15–20℃下密闭培养28天，通过溶解氧分析跟踪降解。至少需要24个瓶子（8个测试物、8个参比物、8个海水加营养物）。
两种方法均仅使用测试海水中原有的微生物，不额外接种。

3.3.3 沉积物与地表水模拟
（1）308 水-沉积物系统中好氧和厌氧转化试验。评估有机化学品在水-沉积物系统中的好氧和厌氧转化。可测定测试物质在水-沉积物系统及沉积物中的转化速率、矿化速率、两相分布、转化产物的鉴定和定量及质量平衡。至少使用两种有机碳含量和质地不同的沉积物，试验通常不超过100天，需确定半衰期、DT50、DT75和DT90值。
（2）309 地表水中的好氧矿化——生物降解模拟试验。测量低浓度测试物质在好氧天然水中的生物降解时间过程，并以动力学速率表达式量化观察结果。分为“水体试验”和“悬浮沉积物试验”两种模式。测试浓度上限小于100 µg/L，最低浓度优选在1–10 µg/L范围，通常培养60天。通过测定残留¹⁴C或残留浓度来跟踪降解，可分别测定总矿化和初级生物降解。

3.3.4 土壤转化
307 土壤中好氧和厌氧转化试验。评估化学品在土壤中的好氧和厌氧转化。实验使用约50至200 g土壤样品，在生物测定瓶或流通系统中黑暗培养，处理速率应相当于作物保护产品推荐最高施用率。试验通常不超过120天，通过适当溶剂提取土壤样品并分析测试物质和转化产物，挥发性产物用吸附装置收集。使用¹⁴C标记材料时，可通过捕集释放的¹⁴CO₂测定矿化速率并建立质量平衡。

3.3.5 厌氧生物降解
311 消化污泥中的厌氧生物降解——测定气体产生法。这是评估有机化学品在厌氧条件下潜在生物降解性的筛选方法。使用洗涤后的消化污泥，稀释约十倍，在密封血清瓶中培养。通过测定试验物质降解产生的总无机碳和甲烷碳，计算其占加入碳量的百分比来评估生物降解程度。该方法填补了OECD指南在厌氧降解测试方面的空白，尤其适用于评估进入污泥消化系统的化学品。

3.3.6 污水排放系统模拟——314系列
314系列是后续新增的模拟测试方法群，用于评估通过污水排放进入环境的化学品在污水传输和处理各关键阶段的初级和最终生物降解程度及动力学。该系列由五个相互关联但独立的模拟试验组成：
（1）314A 化学品在污水管道系统中的生物降解试验：模拟化学品在污水管道中的生物转化，溶解氧浓度较低（0.2–1 mg/L），适用于非挥发性化合物在环境相关浓度下的降解评估。
（2）314B 化学品在活性污泥中的生物降解试验：模拟活性污泥处理过程中化学品的生物降解，通常试验期限为28天。当需要比303A更简化的活性污泥降解数据时可选用。
（3）314C 化学品在厌氧消化污泥中的矿化和转化试验：模拟化学品在厌氧消化污泥中的转化和矿化，通常需要使用¹⁴C或³H标记化合物来评估矿化程度。
（4）314D 化学品在二级出水-地表水混合带中的生物降解试验：模拟经处理的污水排放到地表水混合带中的生物降解，评估化学品在受纳水体中的去除情况。
（5）314E 化学品在未处理直排污水-地表水混合带中的生物降解试验：模拟未经处理的污水直接排放到地表水混合带中的生物降解，适用于评估污水直排场景下的化学品归趋。
314系列的五个方法覆盖了化学品从进入污水管道到最终进入地表水的完整路径，为企业提供了更精细的模拟测试选择。

4 报告指出的关键问题与后续方法的回应
4.1 接种物变异性大
（1）接种物来源、密度、预处理方式，是影响结果的最大因素。
（2）不同实验室、不同污泥来源，结果可能差异很大。
（3）建议：使用更高但不过高的细胞密度，提高重现性。（特别说明：此举是为了在提高测试结果可靠性的同时，不破坏测试的科学意义之间找到平衡。在统计上，确保有足够机会“抽到”能降解测试物质的微生物，并降低因随机性导致的重现性差；同时，在方法学上，必须将接种物自身的干扰（本底呼吸）控制在有效范围以内，并保持测试条件对“环境易降解性”的筛选意义。）

4.2 不溶性和挥发性化学品难测
（1）不溶物难分散、难取样、难分析。
（2）挥发物容易逃逸，导致结果偏低。
（3）报告高优先级建议：制定不溶性物质测试指导，发展两相闭瓶试验（BODIS，Two-Phase Closed Bottle Test），修订301B CO₂产生试验（Sturm法）。（注：两相闭瓶试验（BODIS） 对应国际标准 ISO 10708。该方法专门用于评估难溶性物质的快速生物降解性，与OECD 301系列测试原则兼容，是OECD体系的重要补充，但OECD目前尚未将其列为独立的测试指南。）
（4）后续回应：OECD 310密闭瓶CO₂法（顶空试验）的发布，为挥发性物质提供了快速筛选方法；302C改进的MITI试验（Ⅱ）适用于难溶、易吸附和弱挥发性物质的固有生物降解性评估。

4.3 10天窗口和CO₂收集问题
（1）10天窗口是快速测试的严格条件。
（2）CO₂产生试验（Sturm法）中，CO₂可能留在液体中，导致CO₂产生被低估。
（3）这会影响10天窗口判断，但不一定影响28天最终值。
（4）建议：测定溶解无机碳（DIC），或采用顶空CO₂方法。
（5）后续回应：OECD 310采用顶空设计，直接测定瓶内无机碳，有效避免了CO₂溶解在液体中导致的低估问题。

4.4 通过水平可能偏高
（1）报告认为，60% ThOD和ThCO₂的通过水平可能过高。
（2）有证据显示，大于90% DOC去除时，ThOD可能只有45%至70%。
（3）建议重新考虑，部分情况下可降到50%。
（4）但最终以现行OECD指南为准。

4.5 预暴露接种物
（1）预暴露：让微生物先接触测试物质，可能提高降解能力。
（2）支持者认为，这更接近实际环境。
（3）反对者认为，可能过于宽松，产生“假阳性”。
（4）报告建议：如采用，暴露时间不宜超过15至18天，并需明确报告。

4.6 厌氧、沉积物、土壤、海水
（1）厌氧降解测试需求迫切，尤其对污泥、沉积物中吸附物质。
（2）报告高优先级建议：制定产甲烷降解指南、产甲烷抑制指南。
（3）沉积物、土壤、海水模拟方法也需发展。
（4）后续回应：OECD 311（消化污泥厌氧生物降解——气体产生法）填补了厌氧降解测试空白；308（水-沉积物系统中好氧和厌氧转化试验）和307（土壤中好氧和厌氧转化试验）填补了沉积物和土壤测试空白；306A/306B填补了海水生物降解测试空白；309填补了地表水好氧矿化模拟测试空白；314系列填补了污水排放系统模拟测试空白。

4.7 报告高优先级建议及后续进展
（1）不溶性物质：建议制定测试指导，发展两相闭瓶试验（BODIS）。后续进展：302C适用于难溶物质；314系列中部分方法也可用于不溶性物质评估。
（2）CO₂产生试验：建议修订301B CO₂收集。后续进展：310采用顶空CO₂法，从根本上改进了CO₂收集方式。
（3）沉积物：建议制定水生沉积物降解指南。后续进展：308正式发布，成为OECD标准方法。
（4）厌氧：建议制定产甲烷降解与抑制指南。后续进展：311正式发布，填补了厌氧降解测试空白。
（5）通过水平：建议ThOD/ThCO₂从60%降至50%。后续进展：需以现行OECD指南为准，部分方法已采用60% ThIC等不同参数。
（6）土壤：建议与ISO土壤工作组合作，推动土壤降解方法统一。后续进展：304A和307正式发布，形成了土壤固有生物降解和土壤转化两套方法。

5 对企业合规上市的实际影响
5.1 登记数据要求
（1）欧盟REACH、美国TSCA、日本化审法、中国新化学物质环境管理登记等，通常都关注生物降解数据。
（2）生物降解数据用于判断物质是否持久、是否需进一步测试。
（3）缺少生物降解数据，可能导致登记延迟或补测。

5.2 数据互认降低重复测试
（1）OECD测试指南被理事会采纳后，成为MAD决定的一部分。
（2）OECD成员国应接受其他成员国按OECD指南生成的评估数据。
（3）但通常还需符合GLP原则。
（4）这可以降低多国登记的重复测试成本。

5.3 测试策略决定成本
企业生物降解测试决策路径可以文字转述为：先明确目标市场法规，再判断物质性质，包括溶解性、挥发性、吸附性，然后选择OECD 301、302、303、304、306、307、308、309、310、311、314系列或ISO、EC方法，委托GLP实验室，最后进行数据提交、数据互认或放入注册卷宗。

具体策略包括：
（1）可溶、不吸附、不挥发：优先DOC消减试验或OECD筛选试验。
（2）不溶物：考虑CO₂产生试验、测压呼吸计量法试验、两相闭瓶试验（BODIS）或302C改进的MITI试验（Ⅱ）。
（3）挥发物：需采用密闭瓶法试验、OECD 310密闭瓶CO₂法（顶空试验）或专门改装系统。
（4）快速生物降解测试未达到通过水平：进入固有测试（302A/302B/302C/304A），再决定是否模拟。
（5）高吨位或高关注物质：可能需要模拟测试，可根据物质进入环境的路径选择303A、303B、306A/B、307、308、309、311或314系列中的相应方法。
（6）如果化学品通过污水排放进入环境：314系列提供了从污水管道到最终进入地表水的全路径模拟选项，可根据排放场景选择314A至314E中的合适方法。

6 企业行动清单
（1）明确目标市场：欧盟、美国、日本、中国要求不同。
（2）判断物质性质：溶解性、挥发性、吸附性决定方法选择。
（3）选择最新OECD/ISO/EC方法，避免使用过时方法。
（4）委托有GLP资质的实验室，确保数据可被接受。
（5）在研发早期规划测试，避免临时补数据。
（6）跟踪OECD指南更新，关注310、302C、304A、306A/B、307、308、309、311、314系列等新方法。
（7）通过行业协会或BIAC参与国际评论，反馈企业关切。
（8）与专业法规服务机构合作，降低补测和登记风险。

7 常见问题
Q1：快速生物降解测试达到通过水平，是否等于在任何环境中都快速降解？
不是。快速生物降解测试是筛选工具，达到通过水平通常说明较易降解，但不等于在所有环境条件下都快速降解。
Q2：快速生物降解测试未达到通过水平，是否等于完全不可降解？
不是。未达到通过水平只说明在该严格条件下未通过，需要进一步做固有生物降解或模拟测试。
Q3：不溶性物质怎么做生物降解测试？
需要特殊分散方法，如超声、乳化剂、惰性载体等。报告建议参考ISO不溶物测试指导，并考虑两相闭瓶试验（BODIS）。此外，302C改进的MITI试验（Ⅱ）适用于难溶物质的固有生物降解性评估。
Q4：挥发性物质怎么做？
需使用密闭瓶法试验、OECD 310密闭瓶CO₂法（顶空试验）、顶空分析或专门改装系统，避免物质逃逸导致结果偏低。
Q5：企业可以只做一次测试吗？
不建议。应根据目标市场、物质性质、吨位和用途，制定分层测试策略。
Q6：化学品通过污水排放进入环境，应该选哪个方法？
可考虑314系列。根据排放场景选择：污水管道中选314A，活性污泥处理中选314B，厌氧消化污泥中选314C，二级出水进入地表水混合带选314D，未处理污水直排进入地表水混合带选314E。

8 结语
OECD第2号专题报告告诉我们：生物降解测试不是“做不做”的问题，而是“怎么做对、怎么选准、怎么被监管接受”的问题。1995年报告发布时指出的不溶物、挥发性物质、厌氧降解、沉积物、土壤、海水等测试空白，此后已通过OECD 310、302C、304A、306A/B、307、308、309、311及314系列等新增指南逐步填补。企业必须关注方法适用性、接种物变异性、不溶物和挥发物、厌氧测试等关键点。
对法规专员而言，最重要的行动是：提前规划、选对方法、用对实验室、跟踪更新、准备数据互认。
把生物降解测试从“合规负担”变成“上市加速器”，关键在于理解规则、尊重科学、提前布局。

参考资料
OECD, Detailed Review Paper on Biodegradability Testing, OECD Environment Monograph No. 98, OECD Series on the Test Guidelines Programme No. 2, Paris, 1995.
OECD, Test No. 310: Ready Biodegradability – CO₂ in Sealed Vessels (Headspace Test), OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 2014.
OECD, Test No. 302C: Inherent Biodegradability – Modified MITI Test (II), OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 2009.
OECD, Test No. 303: Simulation Test – Aerobic Sewage Treatment – A: Activated Sludge Units; B: Biofilms, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 2001.
OECD, Test No. 304A: Inherent Biodegradability in Soil, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 1981.
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OECD, Test No. 307: Aerobic and Anaerobic Transformation in Soil, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 2002.
OECD, Test No. 308: Aerobic and Anaerobic Transformation in Aquatic Sediment Systems, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 2002.
OECD, Test No. 309: Aerobic Mineralisation in Surface Water – Simulation Biodegradation Test, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 2004.
OECD, Test No. 311: Anaerobic Biodegradability of Organic Compounds in Digested Sludge: by Measurement of Gas Production, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 2006.
OECD, Test No. 314: Simulation Tests to Assess the Biodegradability of Chemicals Discharged in Wastewater, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3, 2008.
具体测试方法以OECD官网最新发布的Test Guidelines为准。